Phương pháp trắc quang khối xây dựng trên các nguyên lý của kính hiển vi phản xạ giao thoa và kính hiển vi tán xạ giao thoa kế. Thông qua việc chiếu sáng được kiểm soát cẩn thận, Giáo sư và cộng sự tại Đại học Oxford gần đây đã chứng minh rằng lượng ánh sáng bị phân tán bởi các phân tử đơn lẻ có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy và đặc biệt là nó có tương quan trực tiếp với khối lượng phân tử (Hình 1).
Ánh sáng bị tán xạ bởi một hạt có tỷ lệ tuyến tính với thể tích hạt và chỉ số khúc xạ. Do tính chất quang học và mật độ protein chỉ thay đổi vài phần trăm, tín hiệu tán xạ của chúng tỷ lệ thuận với khối lượng chuỗi của chúng - giúp có thể đo khối lượng các phân tử đơn lẻ với ánh sáng, với độ chính xác cao và trong dải khối lớn (Hình 2). Mối tương quan của tín hiệu tán xạ với khối lượng đúng với nhiều loại phân tử sinh học (glycoprotein, axit nucleic hoặc lipid), làm cho phép đo trắc quang khối trở thành một công cụ phân tích phổ biến cho các phân tử sinh học trong dung dịch.
Lợi ích của trắc quang khối
Cho tất cả thông tin dưới thành phần trong mẫu .
Một xét nghiệm cung cấp nhiều kết quả
Độ tinh khiết của mẫu và thành phần
Phương pháp trắc quang khối lượng đo khối lượng phân tử của protein và protein lắp ráp trong dung dịch với độ chính xác cao. Tín hiệu trắc quang khối lượng chia tỷ lệ tuyến tính với khối lượng protein đã biết (cũng như các phân tử sinh học khác) và không phụ thuộc vào hình dạng của chúng. Kết quả là, thông qua hiệu chuẩn đơn giản, trắc quang khối cho phép đo khối lượng của ẩn số với độ chính xác cao (<5 kDa, trung bình 1,9%).
Phức hợp protein - Hội và cân bằng hóa học
Sự tự lắp ráp và kết hợp của các protein củng cố chức năng sinh học của chúng, trong khi tập hợp protein có thể dẫn đến chức năng không hiệu quả, hoặc thậm chí là độc tính. Phương pháp trắc quang khối cung cấp một phương tiện duy nhất để đo lường sự phân bố khối lượng của protein, phát hiện các stoichiometries định lượng thậm chí rất hiếm, trong dung dịch. Điều này cung cấp một cái nhìn tuyệt vời về thành phần của dung dịch protein và một con đường để kiểm tra và tối ưu hóa các điều kiện giải pháp có thể ảnh hưởng đến quá trình oligome hóa hoặc tổng hợp.
Phương pháp trắc quang khối lượng cho phép xác định phân phối cân bằng hóa học của protein. Trong một thí nghiệm trắc quang khối lượng, tín hiệu tương ứng với các sự kiện hạ cánh protein riêng lẻ được phát hiện độc lập với các sự kiện khác. Phát hiện hạt đơn mang lại dải động cao (3 bậc độ lớn trong phổ này) và khả năng phát hiện các loài có độ phong phú thấp, chẳng hạn như tetramers albumin huyết thanh bò (BSA) (0,25%). Độ polydispersity của BSA (monome 67 kDa) được phân giải cơ bản và số lượng tương đối của monome, dimer, trimer và tetramer có thể được định lượng trực tiếp từ số lượng sự kiện hạ cánh.
Đo khối lượng sinh khối phức tạp
Phương pháp trắc quang khối lượng là phổ biến trong khả năng ứng dụng của nó, vì tất cả các phân tử tán xạ ánh sáng, bất kể chúng dựa trên axit amin, lipit, axit nucleic, carbohydrate hay các khối xây dựng khác. Điều này có nghĩa là không chỉ các phân tử có thành phần đơn giản, mà cả các phân tử bao gồm nhiều lớp phân tử sinh học (ví dụ: glycoprotein, protein màng được hòa tan bằng chất tẩy, phức hợp protein-DNA) có thể đo được bằng phép đo khối lượng chính xác bằng phương pháp trắc quang khối lượng.
Sự khác biệt về khối lượng phân tử của các phân tử sinh học không đồng nhất, chẳng hạn như nanodis lipid, có thể phân biệt và có khả năng tái sản xuất cao. Các phép đo sử dụng các kỹ thuật thay thế - sắc ký loại trừ kích thước, quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng động và quang phổ khối tự nhiên - khối lượng trở lại khác nhau khoảng 30% (các vạch màu cam). Phương pháp trắc quang khối có thể gán giá trị khối lượng chính xác cho nanodiscs với các thành phần vành đai protein thay đổi và thành phần lipid. Phân tích các mô phỏng hai lớp lipid, chẳng hạn như nanodiscs, là một khả năng chính cho các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của protein màng.
Tương tác protein-protein
Chức năng của protein, và sự trục trặc của chúng trong bệnh tật, bị chi phối bởi sự tương tác của chúng với bản thân và với các phân tử sinh học khác. Phương pháp trắc quang khối cung cấp một phương tiện mới và mạnh mẽ duy nhất để định lượng các tương tác này theo các đại lượng có ý nghĩa vật lý, chẳng hạn như hằng số phân ly và năng lượng tự do. Điều này mở ra cánh cửa để đo lường sự thao túng của các tương tác này trong phát triển thuốc.
Các tương tác protein-protein phức tạp có thể được định lượng bằng phương pháp trắc quang khối. Các glycoprotein Env của virus HIV được nhắm mục tiêu bởi các virut kháng vi-rút có liên kết với các đơn vị Envs hoặc liên kết chéo. Ở nồng độ thấp của giảng viên, Env chủ yếu là một đơn vị. Ở nồng độ cao hơn, các đơn vị Env bậc cao hơn được phát hiện và được tìm thấy bao gồm các giảng viên bị ràng buộc. Từ đường cong chuẩn độ và lượng tương đối của phức Env-speechin, liên kết liên kết của mỗi tương tác có thể được định lượng cung cấp thông tin chính để hiểu cơ chế chống vi-rút.
Một cách tiếp cận mang tính cách mạng đối với phân tích sinh học - Refeyn One MP bắt đầu một kỷ nguyên mới trong phân tích các phân tử sinh học. Sử dụng công nghệ trắc quang khối lượng, OneMP cho phép đo khối lượng của các phân tử đơn lẻ trực tiếp trong dung dịch. Công nghệ độc đáo này phát hiện một phần ánh sáng bị phân tán bởi các phân tử riêng lẻ tại giao diện quan sát và sử dụng tín hiệu này không chỉ để đếm các phân tử trong dung dịch mà còn để đo khối lượng của chúng. Tất cả điều này được thực hiện đo từng phân tử trong một loạt các dung dịch đệm riêng, mà không cần đánh dấu.
